Introduction

Ces dernières années, les avancées scientifiques sur les cellules souches et en bio-ingénierie ont permis de révolutionner la culture cellulaire avec un changement de dimensions de 2 (2D) à 3 (3D) pour améliorer la pertinence physiologique des études « in vitro ». Ainsi sont nés les « organoïdes », ou mini-organes, qui permettent aujourd’hui de pouvoir reproduire au plus proche de la réalité la physiologie du cerveau, du foie, des intestins, etc. de l’Homme. Leur utilisation représente un grand intérêt en recherche pour évaluer l’efficacité et la toxicité de molécules pharmaceutiques, pour étudier les infections, et pour la médecine régénérative/la transplantation d’organes.

Le développement d’organoïde est initié par la mise en culture de cellules souches ayant des propriétés uniques d’auto-renouvellement et de différenciation. Selon leur origine, on distingue les cellules souches embryonnaires (ESC pour embryonic stem cell) pluripotentes, les cellules souches adultes ou tissulaires mulipotentes, et celles obtenues par reprogrammation somatique, dites cellules souches pluripotentes induites (iPSCs pour induced pluripotent stem cell) (Pain, 2021). Elles sont cultivées dans des milieux contenant divers facteurs de croissance, inhibiteurs de mort cellulaire et des facteurs de différenciation spécifiques des tissus et dans une matrice cellulaire proche de celle existant in vivo avec des laminines et du collagène leur permettant de s'auto-organiser non pas étalées au fond d'une boîte de Pétri, mais en 3D.

Les organoïdes intestinaux font partie des outils de culture cellulaire 3D les plus développés et étudiés à l'heure actuelle. En effet, l'amélioration des connaissances des voies de signalisation impliquées dans le maintien et la prolifération des cellules souches intestinales qui expriment spécifiquement Lgr5⁺, un récepteur orphelin à 7 domaines transmembranaire, a permis le développement rapide des organoïdes intestinaux chez la souris et l'homme (Sato et al., 2009 ; Sato et al., 2011a). Ils peuvent être générés in vitro à partir des cellules souches des différents segments de l'intestin et conservent ainsi toutes les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de leurs tissus d'origine. On appellera alors « entéroïdes » les organoïdes intestinaux dérivés de l'intestin grêle et « colonoïdes » ceux dérivés du côlon (Stelzner et al., 2012). Ces structures 3D auto-organisées sont composées d'une monocouche de cellules épithéliales intestinales polarisée qui récapitule in vitro la composition multicellulaire de l'épithélium intestinal et son architecture avec des domaines cryptiques. Ces « mini intestins » reproduisent également leurs principaux rôles tels que l'absorption des nutriments et la fonction barrière (Sato et al., 2009).

Chez les animaux de rente, quatre revues internationales récentes ont décrit tous les travaux réalisés à partir d'organoïdes intestinaux de différents animaux de ferme et les particularités des milieux de culture de chaque modèle cellulaire (Holthaus et al., 2020 ; Seeger, 2020 ; Beaumont et al., 2021 ; Kar et al., 2021 ; Lacroix-Lamandé et Wiedemann, 2021). Dans cette revue, nous décrirons la composition de l'épithélium intestinal pour mieux comprendre comment la technologie des organoïdes intestinaux a pu se développer. Un état des lieux des différents modèles d'organoïdes intestinaux des animaux de rente fera l'objet d'une autre partie de cette revue pour finir sur quelques applications actuelles et futures de ces outils innovants (tableau 1). Ils ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la recherche animale et répondent à une demande sociétale de limiter l'utilisation des animaux en recherche. C'est pourquoi, un collectif de scientifiques, chercheurs et ingénieurs de INRAE, s'approprient actuellement ces nouvelles méthodologies et ont constitué un groupe de travail (GT Organoïde INRAE) pour échanger et progresser plus efficacement sur cette technologie.

1. Le tractus gastro-intestinal

1.1. Structure et fonctions du tube digestif

Différents compartiments constituent le tractus intestinal depuis la bouche jusqu’à l’anus : l’œsophage, l’estomac, l’intestin grêle lui-même subdivisé en 3 compartiments (duodénum, jéjunum et iléon), le cæcum, le côlon et le rectum. Le duodénum reçoit le chyme alimentaire, le suc biliaire et les sécrétions pancréatiques pour compléter la digestion chimique. Le jéjunum est le site principal d'absorption des nutriments tandis que l'iléon absorbe les nutriments résiduels, les vitamines et les acides biliaires conjugués. Le gros intestin est composé du cæcum et du côlon, dont les fonctions principales sont d'absorber l'eau, les électrolytes et les produits de fermentation microbienne.

Tous ces organes ont la même origine embryonnaire mais exercent des fonctions spécifiques à leur localisation pour permettre la digestion des aliments, la fonction première attribuée à l’intestin. L’intestin joue également un rôle de barrière en permettant le passage spécifique des nutriments lors de la digestion et en prévenant celui de pathogènes. Il est constitué de 4 couches successives permettant d’assurer l’ensemble de ses fonctions (figure 1). La couche la plus externe du tube est appelée la séreuse, elle est accolée à la musculeuse qui est composée de muscles lisses longitudinaux et circulaires et d’un Système Nerveux Entérique (SNE) essentiel à la fonction de motricité intestinale pour l’élimination du bol alimentaire. La 3^ème couche correspond à la sous-muqueuse. Elle est constituée de tissu conjonctif lâche contenant des vaisseaux sanguins et lymphatiques ainsi que les neurones et cellules gliales du SNE. La dernière couche appelée muqueuse est constituée d’un épithélium en contact direct avec la lumière digestive et d’un système immunitaire appelé GALT pour Gut associated lymphoid tissue. L’épithélium constitue une barrière physique entre l’organisme et le milieu extérieur. À cette interface se localise le microbiote intestinal jouant également un rôle important dans la digestion et dans la protection de l’hôte.

Figure 1. Coupe Histologique représentant la paroi de l’intestin grêle.

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L’intestin est un tube creux constitué de quatre couches : la muqueuse, la sous muqueuse, la musculeuse et la séreuse. L : lumière intestinale ; C : crypte

1.2. Composition de l’épithélium intestinal

L’épithélium intestinal recouvre les villosités et les cryptes (figure 1 et 2). Il est formé d'une monocouche de cellules épithéliales différenciées ou prolifératrices situées à l’interface entre milieu extérieur (lumière intestinale) et l’hôte. Les cellules épithéliales différenciées assurent des fonctions de digestion et de défenses physique, en formant une barrière, et immunologique en produisant des agents anti-microbiens et des cytokines ou chimiokines. Les cellules épithéliales en prolifération assurent le renouvellement de l’épithélium qui se produit tous les 3 à 5 jours. La balance entre la prolifération et la différenciation doit être maintenue et finement régulée pour assurer l’homéostasie de l’épithélium intestinal. Cet équilibre est contrôlé par des gradients d’activations spécifiques des grandes voies de signalisation (Wnt, Notch, Bmp) figure 2.

Figure 2. Composition de l’épithélium intestinal.

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L’intestin est un tube recouvert de villosités elles-mêmes recouvertes d’un épithélium monocouche. Différents types de cellules épithéliales composent cet épithélium. Dans les cryptes intestinales, se trouvent les cellules souches Lgr5+ qui prolifèrent et migrent le long de l’axe crypto-villositaire pour se différencier en cellules absorbantes que sont les entérocytes ou en cellules sécrétrices telles que les cellules caliciformes, les cellules entéroendocrines et les cellules Tuft. Les cellules de Paneth sont elles aussi des cellules différenciées mais ne migrent pas, elles restent localisées dans les cryptes et constituent une niche pour les cellules souches. La prolifération des cellules ou leur différenciation implique une régulation fine des voies de signalisation. Ainsi, la voie Wnt est fortement active dans les cryptes et favorise la prolifération et le maintien des cellules prolifératives. La voie Bmp est active dans les villosités et permet la différenciation des cellules. La voie Notch est active dans les cryptes au niveau des cellules progénitrices absorbantes et des cellules souches et permet notamment le choix du lignage de différenciation (cellules absorbante ou sécrétrice) et le maintien de la prolifération.

a. Les villosités

Les cellules spécialisées ou différenciées, recouvrent les villosités dans l'intestin grêle, et se positionnent dans le tiers supérieur des cryptes dans le côlon. Il existe 5 types de cellules différenciées dans l'intestin appartenant à deux grands lignages cellulaires dans cet épithélium : le type absorbant, représenté par les entérocytes, et le type sécrétoire, auquel correspondent les cellules de Paneth, les cellules caliciformes, les cellules entéro-endocrines et les cellules Tuft ou « touffues ». Les entérocytes représentent 80 % des cellules de l'épithélium et ont un rôle dans l'absorption des nutriments. Les cellules entéro-endocrines sont moins nombreuses (1 %) et sont spécialisées dans la sécrétion de peptides et d'hormones (telles que la sérotonine, les catécholamines, l'adrénaline, l'enteroglucagon, du peptide YY et bien d'autres…) pour agir sur la mobilité intestinale et les fonctions digestives. Elles sont stimulées par les produits de digestions (glucose, acides-aminés...) et les produits de de fermentation du microbiote tels que les acides gras à chaine courte (de l'anglais SCFA (short-Chain Fatty Acids). De par leur fonction, elles sont plus nombreuses en partie proximale de l'intestin grêle et les peptides et les hormones qu'elles produisent sont différentes selon leur localisation (Gribble et Reimann, 2019). La fonction de protection est principalement assurée par les cellules de Paneth qui sécrètent des peptides antimicrobiens et les cellules caliciformes qui représentent 5 % des cellules épithéliales spécialisées dans la sécrétion du mucus. Les cellules « touffues » appelées ainsi de par leur aspect en microscopie électronique à balayage, ont plus récemment été décrites et participent à l'immunité antiparasitaire (figure 2). Tous ces types de cellules épithéliales intestinales différenciées dérivent des cellules souches épithéliales intestinales situées à la base des cryptes épithéliales. Ils acquièrent leur spécificité en se différenciant le long de l'axe crypto-villositaire (Gehart et Clevers, 2019). En revanche, les cellules de Paneth restent au fond des cryptes et participent également au maintien de la niche des cellules progénitrices et des cellules souches Lgr5⁺ (Sato et al., 2011b). La distribution des types de cellules épithéliales diffère également le long de l'intestin, ce qui reflète la spécialisation fonctionnelle des segments digestifs (Middendorp et al., 2014).

b. Les cryptes ou niches des cellules souches

Dans les cryptes intestinales, les cellules souches sont appelées les CBC pour crypt base columnar cell et expriment le récepteur Lgr5. Ces cellules prolifèrent activement et possèdent les caractéristiques typiques des cellules souches dans un environnement privilégié appelé « niche ». À chaque division, elles engendrent des cellules progénitrices qui s’amplifient, puis se différencient dans les différents types cellulaires de l’épithélium intestinal (Seishima et Barker, 2019).

La signalisation Wnt/β-caténine participe au contrôle de la prolifération, au maintien des cellules souches, et au renouvellement de l'épithélium intestinal (van der Hee et al., 2020 ; Randall et al., 2011). Si les cellules souches génèrent leur propre niche qui leur assure, par un effet paracrine, un rôle protecteur et instructeur, les cellules avoisinantes telles que les cellules épithéliales adjacentes (cellules de Paneth), les myofibroblastes, les neurones entériques, les cellules endothéliales, les lymphocytes intraépithéliaux et les macrophages participent également à cette « niche ». Dans cette niche sont sécrétés des facteurs activant la voie Wnt tels que Wnt3a, de l'EGF (epidermal growth factor), des ligands des récepteurs Notch pour favoriser la prolifération, et du TGF-α (transforming growth factor-α) (Sato et al., 2011b).

2. Les modèles in vitro pour étudier l’intestin des animaux de rente

Étudier les fonctions de l'épithélium intestinal chez les espèces animales a des implications majeures en recherche que ce soit pour l'amélioration de l'efficacité alimentaire des animaux, pour la santé vétérinaire en décryptant les interactions entre l'intestin des animaux et les agents pathogènes entériques ou encore pour la recherche biomédicale avec l'utilisation des animaux en tant que modèle de maladies humaines. Les modèles couramment utilisés pour étudier l'épithélium intestinal des animaux sont les lignées cellulaires de cellules épithéliales immortalisées. Ces lignées sont disponibles chez le porc (IPEC-J2, dérivées du jéjunum ou PoCo83-3 dérivé du colon) mais n'existent pas pour d'autres espèces animales comme le poulet et le bovin. De plus, elles présentent l'inconvénient majeur de ne pas représenter l'hétérogénéité cellulaire de l'épithélium et par conséquent ne reproduisent pas entièrement la fonctionnalité des tissus (Vergauwen, 2015 ; van der Hee et al., 2020). La culture ex vivo d'explants intestinaux ou de cellules épithéliales intestinales primaires récapitule les principales caractéristiques du tissu in vivo, mais elle ne convient pas aux expériences de longue durée en raison de la viabilité limitée à environ 24 ou 48h (Randall et al., 2011). Le développement récent des organoïdes intestinaux des animaux de rente résout la plupart de ces limitations. Une revue récente décrit les progrès réalisés pour les études in vitro de l'intestin chez l'Homme depuis l'utilisation des lignées cellulaires jusqu'aux organoïdes cultivés sur puce (décrits à la fin de la revue) (Rahman et al., 2021).

3. Les organoïdes intestinaux des animaux de rente

3.2. Culture des organoïdes intestinaux

La culture d’organoïde intestinal est basée sur la reproduction de la niche des cellules souches in vitro. Ainsi, le milieu de culture des organoïdes contient des facteurs permettant de stimuler la voie Wnt (Wnt3a et R-Spondin), de l’EGF important pour la prolifération des cellules souches et du Noggin pour inhiber la signalisation Bmp. Grâce à ces facteurs, les organoïdes croissent et forment au bout de quelques jours des mini-intestins regroupant toutes les cellules différenciées de l’épithélium intestinal. Lorsque des cellules souches d’intestin grêle sont cultivées, des bourgeons contenant des cellules souches ainsi que des cellules de Paneth se forment et reproduisent l’architecture des cryptes (figure 3). Les cellules différenciées se retrouvent hors des cryptes dans des domaines récapitulant l’organisation des villosités. Pour obtenir la structure 3D des organoïdes, les cellules souches épithéliales intestinales sont généralement ensemencées dans du Matrigel^TM, un gel de protéines de la matrice extracellulaire contenant des facteurs de croissance.

Les organoïdes intestinaux humains et murins sont dérivés des cellules souches isolées de tissus intestinaux ou de cellules souches pluripotentes induites ou de cellules souches embryonnaires (Gao et al., 2019). Ces méthodes ont récemment été adaptées à de nombreuses espèces agronomiques, notamment le porc, le lapin, le bovin, le mouton, le cheval et le poulet (figure 4 et tableau 1) (Panek et al., 2018). Les modèles organoïdes intestinaux n'ont pas encore été développés pour les poissons. Des organoïdes intestinaux d'animaux de ferme ont été obtenus avec succès à partir de plusieurs segments digestifs (duodénum, jéjunum, iléon, cæcum et côlon).

Figure 3. Génération et culture d’organoïdes intestinaux.

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Les organoïdes intestinaux sont générés à partir des cellules souches intestinales. Que ce soit pour l’Homme ou l’animal, celles-ci peuvent être purifiées à partir de cryptes isolées de fragments d’intestin ou de biopsies. Elles sont ensuite mises en culture avec des facteurs de croissance adaptés et dans une matrice leur permettant une croissance en 3D. A : Schéma de protocole expérimental pour obtenir des organoïdes intestinaux en culture. B : Images de microscopie optique illustrant le développement au cours du temps des organoïdes intestinaux en culture à partir d’ensemencement de cellules de cryptes intestinales.

a. Isolement des cellules souches intestinales

La première étape de la culture d’organoïdes intestinaux des animaux de rente consiste à isoler les cryptes intestinales contenant les cellules souches avec des protocoles proches de ceux utilisés pour l’Homme et la souris. À partir du prélèvement d’intestin du segment désiré, des étapes d’incubation et d’agitation avec des tampons de dissociation généralement à base d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et du dithiothréitol (DTT) sont réalisées. Selon les espèces et les segments digestifs, la concentration en EDTA varie énormément de même que le temps et la température d'incubation. Dans certains cas, un inhibiteur de la mort des cellules épithéliales, le Y27632, est ajouté lors de la purification. Les cryptes isolées sont ensuite ensemencées dans du Matrigel^TM et le milieu de croissance est ajouté.

b. Mise en Culture des cryptes intestinales

Face à la diversité des facteurs nécessaires à la culture des organoïdes, la difficulté à obtenir des molécules recombinantes spécifiques de chacune des espèces animales étudiées aurait pu constituer un frein au développement de ces nouveaux modèles de culture. Toutefois, la conservation évolutive élevée des séquences en acides aminés des facteurs de croissances entre les espèces animales a rendu possible la culture d'organoïdes intestinaux à partir de facteurs humains ou murins (Panek et al., 2018 ; Mussard et al., 2020). Ainsi, de très nombreuses études rapportent l'utilisation du milieu conditionné de cellules L-WRN (lignée cellulaire L de souris sécrétant Wnt3a, R-spondin et Noggin, ATCC® CRL-3276™) pour cultiver des organoïdes intestinaux de plusieurs espèces comme le poulet et le lapin (Panek et al., 2018 ; Mussard et al., 2020). Comme décrit précédemment, le développement des organoïdes intestinaux à partir des cellules souches est possible en inhibant la signalisation de la voie Bmp par le Noggin, en stimulant la prolifération des cellules souches épithéliales par la R-Spondin et la protéine Wnt3a, cette dernière participant également à la différenciation des cellules épithéliales. Très récemment, la R-Spondin et la protéine Wnt3a du poulet ont été produits en lignée HEK293t et leur utilisation a permis d'augmenter la longévité des cultures d'organoïdes intestinaux de poulets (Oost et al., 2022). Pour faciliter la croissance des organoïdes intestinaux, le milieu peut également contenir de l'EGF, ou des suppléments de culture cellulaire tels que des vitamines ou des mélanges complexes commercialisés tels que les suppléments N2 et B27.

Figure 4. Organoïdes intestinaux dérivés de cryptes jéjunales de poulet cultivés en milieu L-WRN.

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A : Image de microscopie optique d’organoïde mature en culture. B-C : Caractérisation du modèle organoïde intestinal aviaire par microscopie électronique à transmission. La face luminale (L) de l’organoïde est apparente dont la surface est décorée d’une bordure en brosse (visualisée avec un astérisque). M indique une cellule à mucus qui fait face à la lumière et la flèche indique les jonctions intercellulaires caractéristiques de l’organisation polarisée des cellules.

Pour pallier le manque de molécules recombinantes spécifiques d'espèce, une autre approche a été de cultiver des organoïdes intestinaux de porc et de bovin avec du milieu de croissance commercial optimisé par STEMCELL Technologies (Vancouver, Canada) pour la souris et les organoïdes humains (Derricott et al., 2019 ; Li et al., 2019a ; Li et al., 2019b ).

Enfin, l'utilisation d'inhibiteurs ou d'activateurs synthétiques des voies de signalisation essentielles à la physiologie intestinale est également un moyen de s'affranchir de la disponibilité des molécules recombinantes. Ainsi l'inhibiteur CHIR99021 peut être utilisé pour inhiber la glycogène synthase kinase 3 et ainsi activer la voie Wnt dans la culture d'organoïdes intestinaux de porc, bovin, cheval et lapin (Stewart et al., 2018 ; Derricott et al., 2019 ; Mussard et al., 2020 ; Zhou et al., 2020). Dans plusieurs études, la prolifération épithéliale et l'inhibition de la différenciation ont été facilitées par les inhibiteurs du récepteur TGFβ (LY2157299, A8301, SB43542) et l'inhibiteur de p38 MAPK SB202190 (Holmberg et al., 2017). Enfin, il est possible de remplacer le Noggin par l'inhibiteur de la voie Bmp LDN193189 comme cela a été décrit pour la culture d'organoïdes de cæcum de lapin (Mussard et al., 2020). Un autre inhibiteur est classiquement utilisé pour la culture d'organoïdes intestinaux pour empêcher la mort des cellules épithéliales isolées, l'inhibiteur ROCK, Y27632 (Li et al., 2019b).

Pour améliorer la culture et plus précisément la différenciation des organoïdes intestinaux, il est possible de moduler les concentrations des facteurs de niche tels que Wnt3a ou Noggin comme cela a été décrit les organoïdes du cæcum de lapin (Mussard et al., 2020) et les entéroïdes bovins (Hamilton et al., 2018 ; Topfer et al., 2019).

c. Culture dans le temps des organoïdes intestinaux

Dans tous les épithélia, la cellule épithéliale est dite « polarisée ». En effet, elle repose sur une membrane basale ce qui permet de lui définir un pôle basal, en contact avec la membrane basale et un pôle apical exposé au milieu « extérieur ». Cultivés en 3D dans une matrice, classiquement dans du Matrigel^TM, l'épithélium des organoïdes intestinaux acquiert cette caractéristique de polarisation avec la partie apicale vers l'intérieur de l'organoïde. Cette orientation de l'épithélium intestinal peut présenter des inconvénients à l'utilisation de ce modèle in vitro. Le premier est directement relié aux caractéristiques intrinsèques de l'épithélium intestinal réputé pour sa vitesse de renouvellement, qui est la plus élevée de l'organisme et qui entraîne une quantité importante de cellules mortes s'accumulant dans la lumière des organoïdes classiques. Cette accumulation excessive au cœur de l'organoïde de cellules mortes, par le phénomène d'anoïkose, nécessite de les dissocier en moyenne chaque semaine pour les maintenir dans une culture viable. L'autre inconvénient dépend de la question scientifique pour laquelle l'outil va être utilisé. En effet, pour des études des interactions microbiote-épithélium, ou pathogènes-épithélium ou encore pour étudier le devenir de nutriments, l'accès au pôle apical de l'épithélium est indispensable. La technique de micro-injection est un moyen d'accéder à la lumière de l'organoïde, cependant, elle nécessite un appareillage et une technicité complexe qui ne sont pas adaptées à tous les questionnements scientifiques et notamment aux applications à haut débit (Puschhof et al., 2021).

Pour pallier cet inconvénient majeur, d'autres façons de cultiver les organoïdes intestinaux ont été décrits à partir de ce qui a été réalisé chez l'homme et la souris. Les organoïdes peuvent être dissociés en plus petits fragments ou cellules isolées mécaniquement ou par digestion enzymatique. Les fragments peuvent ainsi être exposés aux pathogènes ou à des nutriments puis re-ensemencés en Matrigel^TM pour se réorganiser et se transformer de nouveau en organoïdes. L'inconvénient de cette méthode est la perte probable de polarité de l'épithélium une fois dissocié, ce qui signifie que son exposition aux pathogènes ou à des nutriments n'est pas très représentatif de la situation in vivo. Une autre approche consiste à ensemencer les cellules isolées dans une configuration monocouche 2D sur une membrane de type Transwell. Elle a été décrite pour les organoïdes intestinaux de poulet (Orr et al., 2021), de cheval (Hellman, 2021), de lapin (Mussard et al., 2020 ; Kardia et al., 2021) et de porc (Hoffmann et al., 2021). Les cellules sont alors capables de former une barrière avec un épithélium polarisé donnant un accès facilité au pôle apical. Enfin, plus récemment, il a été décrit que les organoïdes intestinaux peuvent être maintenus en culture en suspension induisant une inversion de la polarité des cellules épithéliales de sorte que la membrane apicale soit tournée vers l'extérieur (Co et al., 2019 ; Co et al., 2021). Cette culture en suspension a été décrite avec des cryptes isolées du côlon et du jéjunum porcins et de caeca de poulet (Li et al., 2020 ; Joo et al., 2022 ; Nash et al., 2021). La figure 5 illustre une gamme de différentes méthodes utilisées pour avoir accès au pôle apical des cellules épithéliales de l'organoïde intestinal.

Figure 5. Méthodes de culture pour accéder au pôle apical des cellules épithéliales.

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Les cellules épithéliales sont dites « orientées » avec un pôle apical (A), exposé à l’environnement extérieur, et un pôle basal (B). La majorité des agents pathogènes à porte d’entrée intestinale envahit l’hôte par le pôle apical des cellules. L’inconvénient majeur de la culture des organoïdes en 3D est la difficulté d’accéder au pôle apical des cellules qui se trouve à l’intérieur de l’organoïde. Pour cela, 4 méthodes ont été décrites afin d’étudier par exemple les interactions hôtes-micro-organismes (pathogènes ou commensaux).

4. Les applications des modèles d’organoïdes intestinaux chez les animaux de rente

5. Complexification des modèles d’organoïdes intestinaux des animaux de rente dans le futur…

Des avancées récentes ont montré qu’il était possible de complexifier encore plus les modèles de culture d’organoïdes intestinaux, essentiellement humains et murins, pour obtenir un modèle in vitro le plus physiologique possible. Pour cela, des composantes du système nerveux entérique, des cellules immunitaires, des contraintes mécaniques reproduisant le péristaltisme, ou encore une exposition à du microbiote peuvent être ajoutés à la culture in vitro pour reproduire au mieux la complexité de l’environnement intestinal.

c. Intestin sur puce : de la fluidique pour permettre la co-culture d’un épithélium avec un microbiote intestinal complexe

Les nouveaux dispositifs dit « d’intestin sur puce » représentent une technologie révolutionnaire pour reproduire au mieux le compartiment intestinal en complexifiant la culture « statiques » des cellules épithéliales intestinales. Il comporte un dispositif microfluidique qui reproduit la structure physique, le microenvironnement, les mouvements et la circulation des fluides dans l'intestin (figure 6). Le développement de ces modèles offre des perspectives inespérées pour accélérer la recherche sur le microbiote intestinal et leur utilisation en santé humaine et animal.

Figure 6. Dispositif d’un intestin sur puce.

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En effet, le rôle du microbiote intestinal vis-à-vis de la santé est un domaine de recherche en pleine expansion et une thématique porteuse d’innovation en santé humaine et animale. Les connaissances autour du microbiote intestinal sont source de nouvelles solutions préventives ou thérapeutiques qui intéressent de nombreux secteurs industriels (agroalimentaire, pharmaceutique, diagnostic, ou nutrition-santé, humaine ou animale).

La croissance de communautés bactériennes intestinales complexes est faisable in vitro mais nécessite des conditions de milieu et d'oxygénation particulières. Le dispositif dit « intestin sur puce » permet d'introduire une culture stable de communautés microbiennes complexes au contact des cellules épithéliales d'organoïdes. Le cœur du dispositif est une puce miniaturisée qui comprend une membrane poreuse sur laquelle sont ensemencées les cellules intestinales entourée de deux micro-canaux pour alimenter respectivement les pôles apical et basal des cellules épithéliales. Cette disposition permet de simuler la barrière entre la lumière intestinale et le système vasculaire drainant. L'apport continu de nutriments est assuré par les canaux de microfluidique reliés à des pompes. Parce que ce dispositif permet d'appliquer des conditions de culture distinctes entre deux compartiments, c'est aujourd'hui l'outil le plus performant et le plus pertinent pour modéliser in vitro les interactions entre cellules digestives et les micro-organismes (Siwczak et al., 2021). Aujourd'hui, ce dispositif n'a pas encore été utilisé avec les organoïdes des animaux de rente mais seulement à partir d'organoïdes humain (Kasendra et al., 2018 ; Beaurivage et al., 2020). Il a notamment permis de montrer qu'il était possible de maintenir des communautés bactériennes avec plusieurs espèces sur une période de quelques jours à quelques semaines (Marzorati et al., 2014 ; Kim et al., 2016). Des études plus récentes sur ce nouveau modèle de puces démontrent la possibilité de cultiver des bactéries aérobies et anaérobies sur plusieurs jours en soumettant au dispositif un gradient d'oxygène du côté basal au côté luminal (Jalili-Firoozinezhad et al., 2019). La complexité de ce nouveau dispositif avec une architecture physique « Crypte -villosités » et des paramètres physiologiques de flux continus et de péristaltisme semble également reproduire des conditions favorables pour une infection par des agents pathogènes entériques. Lors d'une infection in vitro par la bactérie pathogène humaine Shigella, l'expression des facteurs d'invasion est activée favorisant ainsi son entrée dans les cellules épithéliales (Grassart et al., 2019).

Conclusion

De plus en plus et dans de nombreux domaines, les organoïdes remplacent les modèles de culture in vitro traditionnels. En élevage, le développement de cet outil biologique est d'autant plus important qu'il représente le seul modèle cellulaire disponible pour certaines espèces et permet de réduire le nombre d’animaux en expérimentation répondant ainsi au principe des 3R et à la demande sociétale. La création de biobanques d'organoïdes intestinaux d'animaux d'élevage disponibles en tant que ressources ouvertes pour la communauté des chercheurs contribuerait également à la réduction des expérimentations sur des animaux vivants. Comme condition préalable à la création de biobanques partagées, l'harmonisation des protocoles utilisés pour la culture d'organoïdes intestinaux d’animaux de rente (par exemple la composition des milieux de culture) et la proposition de lignes directrices pour assurer la reproductibilité des modèles entre les laboratoires sont absolument nécessaires.

Les domaines d'application des organoïdes intestinaux des animaux de rente sont très nombreux pour les études à la fois en recherche fondamentale et en recherche appliquée. Mieux comprendre les infections (sensibilité ou résistance de l'hôte à une infection, ou expression de facteurs de virulence des pathogènes dans un environnement particulier…), l'efficacité alimentaire ou encore analyser le génome sont autant de questionnements qui seront plus faciles à appréhender avec ces nouveaux outils. Ils seront également très utiles pour la recherche appliquée avec principalement des criblages de molécules/microbes pour améliorer la santé intestinale des animaux. Ils ne remplaceront pas les essais sur les animaux, mais permettront de sélectionner les molécules/microbes intéressants à tester in vivo et ainsi réduire le nombre d'animaux utilisés. Ces modèles ayant démontré leur intérêt en recherche, ils ont plus récemment été développés pour les chiens et permettent d'envisager en santé vétérinaire une thérapeutique adaptée pour les animaux de compagnie à partir d'une biopsie intestinale (Chandra et al., 2019 ; Ambrosini et al., 2020 ; Kramer et al., 2020).

L’utilisation de ces outils devient donc incontournable pour les recherches futures et en association avec d’autres nouvelles technologies telles que l’édition des génomes, ces outils représentent des accélérateurs technologiques pour accroitre rapidement les connaissances en recherche humaine et animale.

Contribution des auteurs

Sonia Lacroix-Lamandé (sonia.lamande@inrae.fr) et Agnès Wiedemann (agnes.wiedemann@inrae.fr) ont contribué de façon similaire à l’élaboration cet article.

Remerciements

Les illustrations présentées dans cet article sont issues de travaux financés par le projet ANIMALT FEDER/Region Centre Val de Loire (FEDER convention EX007516, Region Centre 2019-00134936, programme AE-2019-1850), le projet Européen Veterinary Biocontained research facility Network (VETBIONET) et la Fédération de recherche en Infectiologie de la Région Centre Val de Loire (FéRI).

Nous remercions Ophélie Bernardi et Anissa Gagneux pour leur aide technique et Julien Burgault-Gaillard de la plateforme de microscopie de l’Université de Tours pour les images de microscopie électronique à transmission.

Nous remercions le GT organoïdes INRAE et plus particulièrement Dr. Martin Beaumont, Dr. Fany Blanc, Dr. Claire Cherbuy, Dr. Giorgia Egidy et Dr. Elisabetta Giuffra avec qui nous avons rédigé une revue internationale sur les organoïdes intestinaux des animaux de rente (Beaumont et al., 2021) et dont cette synthèse découle en partie. Enfin, nous tenons également à remercier Dr. Sandrine Menard pour la relecture de cette synthèse.

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