Le cerveau est un des organes les plus complexes d’un organisme et son accès est délicat aussi bien au cours du développement que de la vie post-natale des individus. Chez les mammifères, toute approche de biopsie est quasi impossible sans modifier sa structure et son organisation intégrée, et donc potentiellement son activité. Cela le distingue d’autres tissus plus plastiques, plus ‘régénérants’ comme la peau, l’intestin, le foie, la moëlle, le tissu adipeux, etc, pour lesquels des biopsies plus ou moins invasives sont possibles sans qu’elles n’endommagent à long terme, la structure du tissu qui va se renouveler. Cela est vrai dans toutes les espèces dont l’homme, les animaux modèles et ceux d’intérêt agronomique. En conséquence, il est difficile d’évaluer les processus morphogénétiques, développementaux et surtout pathologiques qui peuvent affecter ce tissu par des approches analytiques.

Le développement de modèles in vitro qui visent à mimer le développement de cet organe et à proposer de nouvelles approches pour l’étude des processus pathologiques est très attendu et constitue un enjeu majeur du domaine des neurosciences humaines et agronomiques.

Comme souligné, il est particulièrement délicat d'accéder au tissu cérébral et les modèles cellulaires sont une des voies privilégiées pour étudier le développement du cerveau et mimer son dysfonctionnement. Les cellules souches pluripotentes (CSPs) sont rapidement apparues comme le modèle de choix par leur propriétés uniques. D'abord utilisées dans des approches de cellules adhérentes en monocouche (2D), de nouvelles approches tridimensionnelles (3D) ont été développées, notamment avec la mise au point des organoïdes cérébraux (Eiraku et al., 2008 ; Lancaster et al., 2013).

Différents types de cellules souches peuvent générer des organoïdes, selon leur origine développementale ou tissulaire (Rossi et al., 2018). Dans une description très générale, les principales étapes pour générer un organoïde sont tout d'abord la prolifération initiale de cellules souches et précurseurs dans une structure 3D, puis leur différenciation sous l'effet d'inducteurs (milieux, facteurs de croissance, petites molécules chimiques, matrice…). Des changements dans les conditions de culture sont mis en place séquentiellement pour guider cette différenciation et l'ensemble du processus assure le développement et la maturation de l'organoïde qui présente alors une architecture et plusieurs types cellulaires représentatifs du tissu. Les cellules souches cancéreuses peuvent également produire dans certaines conditions de culture des structures tridimensionnelles (tumoroïdes), mais ne sont pas considérées dans le contexte présenté ici.

Dans la suite de cette revue, nous présentons successivement les cellules souches pluripotentes, la production et l’utilisation des organoïdes, notamment dans une perspective d’interaction hôte-pathogènes pour l’étude des encéphalites virales (avec l’exemple du cheval) avant de mettre en perspective les développements en cours pour complexifier encore davantage ces structures uniques que sont les organoïdes cérébraux.

Les CSPEs ont été isolées pour la première fois dans les années 1980 à partir d'embryons murins (Evans et Kaufman, 1981). Caractérisées par leur auto-renouvellement et leur potentiel de différenciation in vitro, les CSPEs de souris ont également la propriété unique de contribuer en plus du chimérisme somatique à la colonisation de la lignée germinale d'un embryon lorsqu'elles sont injectées dans un blastocyste préimplantatoire. Les CSPEs de primates non humains et humains ont été obtenues pour la première fois dans les années 1990 (Thomson et al., 1995, Thomson et al., 1998) à partir de culture d'embryons préimplantatoires. Selon les espèces, les conditions de culture restent le point critique dans l'établissement et la plasticité de ces cellules.

Dans les années 2000, des cellules souches épiblastiques (EpiSCs) ont été isolées à partir d'un embryon de souris post-implantation (Brons et al., 2007 ; Tesar et al., 2007). Contrairement aux CSPEs, les EpiSCs n'ont pas la propriété de contribuer au chimérisme in vivo bien qu'elles conservent les propriétés de différenciation in vitro dans les trois lignées embryonnaires (l'ectoderme, l'endoderme et le mésoderme). La propriété de colonisation de l'embryon et, en particulier, de colonisation germinale est actuellement considérée comme l'un des critères les plus exigeants, permettant de distinguer les CSPEs dans un état dit « naïf » versus un état « amorcé », dont l'archétype est représenté par les EpiSCs (Nichols et Smith, 2009). De nombreuses publications ont caractérisé ces deux types de cellules souches qui diffèrent à la fois par leurs conditions de culture et leur potentiel développemental ainsi que par leurs caractéristiques moléculaires et épigénétiques (Marks et al., 2012 ; Martello et al., 2012 ; Tosolini et al., 2018).

Plus récemment, un état formatif a été introduit comme « une troisième phase, appelée pluripotence formative, proposée pour exister dans le cadre d'un continuum de développement entre les phases naïve et amorcée » (Smith, 2017), état qui a pu être « capturé in vitro à la fois dans le modèle murin et humain (Kinoshita et al., 2021a).

L'existence de ces mêmes stades - naïf, amorcé et formatif - chez d'autres espèces que les rongeurs est encore largement débattue, notamment dans les modèles primates non humains et humains, pour lesquels de nombreux travaux ont tenté de définir des conditions de culture pour obtenir et maintenir des cellules naïves (Nakamura et al., 2016). En particulier, l'utilisation de différents cocktails de petites molécules inhibant les voies de signalisation a été décrite, permettant d'obtenir des cellules naïves (Guo et al., 2016 ; Bredenkamp et al., 2019).

Chez les espèces d'intérêt agronomique, des cellules de type « souches pluripotentes embryonnaires – CSPEs » avec des propriétés d'auto-renouvellement et de différenciation ont été isolées, amplifiées et établies en lignées chez les porcins (Park et al., 2013 ; Gao et al., 2019 ; Zhi et al., 2022), les bovins (Bogliotti et al., 2018), les ovins et caprins (De Kumar et al., 2011 ; Vilarino et al., 2020), les équins (Paris et Stout, 2010) et les lapins (Tancos et al., 2012). La plupart de ces cellules sont caractérisées par leur potentiel de prolifération et de différenciation in vitro et par la présence de certains marqueurs, comme les antigènes de surface, dont SSEA1, SSEA3 et SSEA4, des antigènes initialement identifiés chez la souris mais dont la réactivité croisée avec d'autres espèces s'est avérée importante pour l'identification de ces cellules. Mais leur potentiel développemental n'a pas été évalué (Koh et Piedrahita, 2014 ; Ezashi et al., 2016).

Plus récemment, en utilisant des stratégies similaires à celles développées pour les cellules humaines (à base de cocktails de molécules inhibitrices), des études ont été menées pour obtenir des CSPEs plus « naïves » chez les espèces bovine et porcine même si des expériences de chimères n'étaient pas mentionnées (Bogliotti et al., 2018 ; Gao et al., 2019). En parallèle, des analyses moléculaires réalisées au niveau de cellules isolées d'embryons préimplantatoires ont permis de mieux définir les marqueurs associés à ces stades précoces chez différentes espèces (bovins, porcs, lapins) et de les comparer avec la souris, le primate non humain et l'humain (Bernardo et al., 2018 ; Ramos-Ibeas et al., 2019). Les dernières conditions mises au point pour les espèces bovine, porcine et ovine, calquées sur l'état formatif humain (Kinoshita et al., 2021a), semblent permettre l'obtention de lignées de cellules capables de coloniser efficacement les embryons, comme démontré dans le modèle porcin (Kinoshita et al., 2021b). Ces cellules seraient ainsi d'excellents supports pour le développement de nouvelles approches in vivo et in vitro, notamment pour l'obtention des organoïdes cérébraux

La mise au point de la reprogrammation somatique en 2006 a constitué une véritable révolution dans le domaine des CSP (Takahashi et Yamanaka, 2006). En criblant un ensemble de 24 gènes tous fortement exprimés dans les CSP, l'équipe de S. Yamanaka a ainsi identifié une combinaison minimale de quatre gènes, les gènes OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC qui était capable de « reprogrammer » un fibroblaste c'est-à-dire de donner à cette cellule des propriétés similaires à une CSP. Cette combinaison OSKM est définie comme la combinatoire canonique de la reprogrammation. Ce concept de reprogrammation somatique consiste donc à exprimer une combinatoire de gènes – dont des facteurs de transcription impliqués dans le contrôle de la pluripotence – dans une cellule somatique, conduisant ainsi à sa reprogrammation en cellule souche pluripotente induite (CSPI). Par la suite, d'autres combinaisons ont été identifiées comme OSNL avec OCT4, SOX2, NANOG et LIN28) (Yu et al., 2007) ainsi que le rôle d'autres gènes comme NR5A2, ESRRB, GLIS1, ZIC3, TBX3, H1F00, NKX3.2, et MIR302 (liste non exhaustive). Ces facteurs participent directement au processus de reprogrammation ou augmentent son efficacité (David et Polo, 2014). Les CSPIs partagent la plupart des propriétés des CSPEs mais sans le questionnement éthique de l'utilisation et de la destruction des embryons lors de leur mise en culture. De plus, par cette approche de reprogrammation, des CSPIs peuvent être obtenues à partir de n'importe quel individu ou animal, sain ou malade, porteur de mutation génétique ou non, et donc de tout génotype ouvrant entre autres aussi la voie à l'étude de nombreuses pathologies, voir à une médecine personnalisée pour l'Homme. Initialement démontré dans le modèle murin, le concept a été rapidement étendu aux primates non humains, à l'homme (Yu et al., 2007) et à de nombreuses autres espèces agronomiques comme les lapins (Honda et al., 2013 ; Osteil et al., 2013), les moutons et les bovins (Liu et al., 2012 ; Sandmaier et al., 2015 ; Talluri et al., 2015), les porcs (Ezashi et al., 2009 ; Rodríguez et al., 2012 ; Congras et al., 2016) et les chevaux (Nagy et al., 2011 ; Breton et al., 2013). Cependant, chez la plupart de ces espèces, il est difficile de valider le statut complet des cellules reprogrammées car leur potentiel de développement est rarement testé (De Los Angeles et al., 2015).

Les propriétés d'auto-renouvellement et de différenciation des CSPEs ou des CSPIs sont les deux propriétés essentielles pour obtenir des organoïdes. Les travaux pionniers du laboratoire de Y. Sasai (Eiraku et al., 2008) dans le modèle neural puis de H. Clevers (Sato et al., 2009) dans le modèle intestinal ont été rapidement popularisés avec le développement de nombreuses approches pour la production d'organoïdes dans la plupart des tissus. La plupart de ces études ont été initialement réalisées sur des modèles murins et humains et, à ce jour, peu de données sont disponibles pour d'autres espèces, en particulier agronomiques et aucune pour les organoides cérébraux (Augustyniak et al., 2019 ; Pain, 2021 ; Pain et al., 2021).

Le développement des organoïdes cérébraux humains a été initié avec les travaux pionniers du laboratoire de J. Knoblich (Lancaster et al., 2013). Les CSPIs humaines sont induites dans la voie neurale de manière contrôlée et la structure obtenue s'auto-organise et se différencie en un organoïde lamellaire multicouche, similaire à la structure observée lors du développement du SNC. Ces premières études ont mis en évidence la nécessité d'un protocole en plusieurs étapes avec diverses conditions de culture. Initialement, les agrégats sont placés dans une matrice qui maintient l'organoïde en suspension et évite la polarisation des cellules. Puis ces gouttes sont placées dans un bioréacteur maintenu sous agitation qui permet le développement de structures 3D pendant plusieurs semaines. Un ensemble diversifié de marqueurs des précurseurs neuraux tels que SOX1, PAX6, TBR2, NESTIN et de marqueurs neuronaux exprimés plus tardivement tels que TUJ1, MAP2, CTIP2, SATB2, etc., est utilisé pour suivre le développement et la différenciation des organoïdes cérébraux (figure 2).

Le « développement du cerveau humain présente une organisation unique de la zone progénitrice », c'est-à-dire que la présence de la zone sous-ventriculaire externe (OSVZ) est typique du néocortex de l'homme et des primates non humains (Dehay et al., 2015). Or comme les marqueurs de ces zones étaient présents et organisés dans les organoïdes de façon similaire au tissu in vivo, il a été conclu que la structure 3D obtenue pouvait bien récapituler au moins certains aspects du développement cortical précoce humain (Lancaster et al., 2013).

Table

A) Le processus de production des organoïdes cérébraux débute par l’agrégation des hiPSCs et leur induction dans un milieu d’induction neurale. Différentes conditions de cultures permettent alors d’obtenir des organoïdes cérébraux qui se différencient et s’engagent dans des processus de maturation aboutissant à la formation de structures complexes avec des rosettes apparentes (B), rosettes qui expriment différents marqueurs analysés à 58 jours (J58) après induction comme SOX1, NESTIN et N-CADHERIN (C) ou KI67, marqueur de la prolifération des précurseurs qui sont PAX6 et TBR2 positifs (D).

En raison de la similitude dans leur développement et de l'architecture tissulaire obtenue, même encore imparfaite, les organoïdes cérébraux humains sont des modèles in vitro de plus en plus utilisés dans les études sur le neurodéveloppement, la modélisation des pathologies neurodégénératives, l'évaluation de la toxicité de molécules et pour l'étude de nombreuses encéphalites d'origine bactérienne ou virales (Arlotta, 2018). Les organoïdes cérébraux ont montré leur potentiel élevé lorsque le virus Zika est apparu en Amérique du Sud en 2016 et a été déclaré urgence de santé publique par l'Organisation mondiale de la santé en raison de son association possible avec de multiples cas de microcéphalie chez les nouveau-nés. Ils ont été utilisés pour démontrer le rôle causal du virus dans cette maladie dévastatrice ainsi que pour élucider les mécanismes qui conduisent à une altération de la neurogenèse (Qian et al., 2016 ; Krenn et al., 2021) et pour tester des molécules antivirales (Xu et al., 2016). Ce domaine de l'étude des interactions hôte-virus neurotrope et de leurs contrôles est sans doute le plus facilement transposable aux sciences vétérinaires (Antonucci et Gehrke, 2019).

Les virus neurotropes affectant les animaux domestiques appartiennent à de nombreuses familles et genres, dont les Lyssavirus, Flavivirus, Alphavirus, Bunyavirus, etc…. Le virus de la rage, un Rhabdovirus du genre Lyssavirus, est probablement le plus connu des virus neurotropes. Il est capable d'infecter tous les mammifères, mais les chiens, les carnivores sauvages et les chauves-souris sont considérés comme ses réservoirs naturels. Dans 99 % des cas, la transmission à l'homme se fait par le chien. Elle induit une encéphalite aiguë et progressive, avec une létalité proche de 100 % (Green, 1997). Le virus de la stomatite vésiculeuse, un autre Rhabdovirus mais du genre Vesiculovirus, affecte les porcs, les bovins et les chevaux dans l'hémisphère occidental. Il est rarement zoonotique mais une infection chez l'enfant a cependant été décrite (Rodríguez, 2002). Les Flavivirus de la famille des Flaviviridae forment un autre genre comprenant de nombreux virus neurotropes responsables d'encéphalites chez l'homme et le cheval (virus West Nile, virus de l'encéphalite japonaise, virus de l'encéphalite de Saint-Louis, virus de l'encéphalite de Murray Valley…) et chez l'ovin (virus Louping Ill) (Kumar et al., 2018). Les encéphalites à Louping Ill sont cependant rares chez l'homme (Desole et al., 2019). Les Alphavirus, (virus des encéphalites équines de l'Est, de l'Ouest et Vénézuélienne) et le mammalian 1 orthobornavirus de la famille des Bornaviridae peuvent également provoquer des encéphalites, potentiellement mortelles, chez l'homme et le cheval. (Lecollinet et al., 2019). Les hénipavirus, dont l'émergence s'est produite dans les années 1990, provoquent également des encéphalites chez l'homme et les animaux avec des taux de mortalité très élevés dans les deux cas. Les virus Nipah et Hendra ciblent respectivement les porcs et les chevaux. Les humains sont infectés soit directement par les chauves-souris (leur réservoir naturel) soit par contact avec des porcs et des chevaux infectés (leur hôte amplificateur) (Weatherman et al., 2018 ; Wang et Anderson, 2019). Parmi les virus non zoonotiques, le virus Schmallenberg, un Bunyavirus apparu en Allemagne en 2001 et transmis par des vecteurs Culicoides, affecte les ruminants (principalement bovins, mais aussi ovins, caprins et ruminants sauvages) et induit diverses lésions neurologiques (cécité, ataxie, paralysie, convulsions et sévères malformations du cerveau du veau au cours du développement) (Conraths et al., 2013) et le virus de l'encéphalomyélite hémagglutinante porcine, un coronavirus, induit une encéphalomyélite chez les porcelets de moins de 3 semaines (Dong et al., 2014). Enfin, l'herpès virus équin 1, distribué dans le monde entier est responsable de myéloencéphalopathies chez les chevaux (Oladunni et al., 2019). À noter qu'à l'exception des chevaux qui sont fortement touchés par de nombreux virus neurotropes, les principales pertes économiques induites par les virus chez les animaux domestiques ne sont pas dues à des troubles neurologiques.

Ainsi, le cheval apparait comme un modèle de choix pour le développement des organoïdes cérébraux. Nos travaux (non encore publiés) et ceux de Fortuna et al. (2018) ont déjà montré que des cellules neurales obtenues à partir de CSPI équines pouvaient être infectées par des Flavivirus et Alphavirus neurotropes, ouvrant la porte à des infections des organoïdes cérébraux équins. L'avantage d'un modèle 3D versus les cellules 2D réside notamment dans la complexité des interactions cellulaires qui sont présentes dans l'architecture tridimensionnelle de ces structures plus similaires au tissu que la culture 2D. En se basant sur une approche similaire à celle développée avec les CSPI humaines, nous avons obtenu, par reprogrammation somatique de cellules de l'oreille, des CSPI équines. Puis, selon une cinétique proche de celle suivie avec les cellules humaines, nous avons induit la formation d'organoides cérébraux (figure 3). Ces nouveaux modèles équins seront prochainement utilisés pour mimer les processus d'infection par des virus neurotropes.

Table

À partir de biopsies de tissus équins, notamment d’oreille, des cellules souches pluripotentes induites sont obtenues par reprogrammation somatique (avec le virus Sendaï apportant les facteurs de reprogrammation). Ces cellules sont induites en organoïdes cérébraux selon des protocoles similaires à ceux développés pour les organoïdes humains. Les marqueurs associés sont également très similaires à ceux détectés dans les organoïdes humains. Ces nouveaux modèles équins sont une base d’exploration originale des interactions hôte-pathogènes de virus neurotropes affectant à la fois l’homme et le cheval.

Les récentes évolutions dans l’obtention de CSPEs et CSPIs les plus plastiques possibles dans les espèces de mammifères d’intérêt agronomique permettent d’envisager le développement de nouveaux protocoles pour obtenir des organoïdes cérébraux très similaires à ceux obtenus chez l’homme. Ceux-ci sont devenus un outil indispensable en neurosciences et on peut s’attendre dans les années qui viennent à de réelles avancées en recherche vétérinaire dans ce domaine, notamment pour les études des interactions hôtes-pathogènes neurotropes.

Les résultats présentés dans cette revue sur le modèle équin ont été obtenus dans le cadre du projet CRB-ANIM - ANR-11-INBS-0003 (BP).